Рост и развитие опухолевых лимфатических капилляров при папиллярном раке щитовидной железы

Cпринджук М.В., Кончиц А.П.

Объединенный институт проблем информатики Национальной Академии Наук Беларуси, Минск, Беларусь

Опубликовано: Журнал «Онкохирургия», 2011, том 3, №3.

---

Основы современных теоретических знаний по патологической анатомии и гистологии рака щитовидной железы были заложены работами A.E. Hertzler (1936) [1] и J.L. De Courcy, C.B. De Courcy (1949).

Прогноз для папиллярного рака щитовидной железы считают благоприятным, однако он зависит от таких факторов, как возраст пациента, стадии распространения и гистологическое дифференцирование. По данным исследования отдаленных результатов лечения, летальность составляет менее 6,5%. Факторы риска развития папиллярного рака щитовидной железы включают предшествующее воздействие на организм ионизирующего излучения, генетические заболевания и узловую (нодулярную) болезнь щитовидной железы.

Общие вопросы развития кровоснабжения и прогрессирования эндокринных опухолей

Ангиогенез и лимфангиогенез как мишени лекарственных средств изучаются в связи с тем, что одна из основных современных гипотез канцерогенеза предполагает, что сосудистая сеть играет ведущую роль в обеспечении опухоли питательными веществами. Заметим, что изучаются патогенетические пути, радикально отличные от ангиогенетической концепции, поэтому можно считать, что канцерогенез – комплексный многогранный механизм, воздействие на который и составляет сущность лечения. Эндокринные железы и опухоли сами представляют собой генераторы биоактивных веществ, влияющих друг на друга и на ткани, соприкасающиеся напрямую или косвенно с кровеносным руслом организма-жертвы. Эти органы подвержены больше других воздействиям окружающей среды, других органов и систем и тонко функционально взаимосвязаны с высшей нервной системой. Щитовидная железа – хорошо кровоснабжаемый орган, в котором гистологически наблюдается ярко выраженная сеть как кровеносных, так и лимфатических капилляров.

D2-40: описание маркера

D2-40 реагирует с O-связанным сиалогликопротеином (МВТ 40 КБ), найденным на лимфатическом эндотелии, эмбриональном яичке и на поверхности тестикулярных гермином. D2-40 – новый селективный маркер лимфатического эндотелия в нормальных тканях и патологических сосудистых. Клон D2-40 показал окрашивание в эндотелии лимфангиом, тогда как гемангиомы, клубочковые опухоли, ангиолипомы, гнойные гранулемы и сосудистые пороки развития не демонстрировали окрашивания этим маркером. D2-40 также прокрашивает энодотелий саркомы Капоши и субпопуляции ангиосарком, а также является специфическим маркером для диагностики злокачественной мезотелиомы (рис.1).

Рисунок 1. Патогистологический препарат папиллярного рака щитовидной железы после программной обработки. Зелеными стрелками отмечены лимфатические капилляры, подсвеченные компьютерной программой черным цветом (увеличение ×200).

Материалы и методы исследования

Исследование выполнялось по материалам Онкологического диспансера г. Минска в течение 13 мес. с 2009 по 2010 гг. Критерии включения пациентов в исследование:

1. больные дети, рожденные позднее 1987 г. (после аварии на ЧАЭС);
2. все пациенты имели диагноз: спорадический папиллярный рак щитовидной железы (на основе тонкоигольной биопсии и обследования удаленной опухоли);
3. возраст варьировал от 9 до 18 лет;
4. у всех больных отсутствовали признаки явной врожденной болезни и значительной сопутствующей патологии.

Программное обеспечение было написано на Delphi для операционной системы Windows. Ключевая функция программного обеспечения – вычисление прокрашенной коричневым цветом области гистологического изображения. Изображения получали при помощи микроскопа Leica DMD 108 с операционной системой Linux. Снимки (150 изображений) делали вручную, без сканера. В основном они визуально соответствовали области максимальной васкуляризации и были выбраны по зрительному оценочному решению одного исследователя как квадрат на увеличении ×40, а затем сняты с увеличением ×200. Все изображения сохраняли в формате tiff, приемлемом для программной обработки.

Программное обеспечение (рис.2) произвело список числовых величин, который импортировали в таблицу Excel.

Рисунок 2. Интерфейс программы, разработанной для количественной оценки русла лимфатических капилляров в щитовидной железе.
Программа считает пакет изображений в указанной директории. Можно одновременно запускать до 10 программ.

Ряды данных адаптировали для программ SPSS 17, STAТA 9.1, NCSS2007&GESS2006, DeltaGraph, SAS_JMP, с помощью которых провели корреляционный (корреляционные пары Пирсона с двусторонним критерием – тестом) и дисперсионный (one-way ANOVA) анализы для зависимых параметров: чисел, полученных путем обработки изображений и ряда клинико-патоморфологических признаков.

Метод компьютерной сегментации лимфатических сосудов с целью их дальнейшего количественной оценки основан на анализе цветового пространства гистологического изображения.

Процедура выделения и анализа состоит из следующих этапов:

1. Преобразование цветовых компонент R, G, B пикселей исходного изображения, представленного в цветовом пространстве RGB, в соответствующие цветовые компоненты в цветовом пространстве HSL (Hue – цветность, Saturation – насыщенность, Luminosity – освещенность). Операцию проводили на основе известных аналитических выражений, преобразующих R, G, B компоненты в H, S, L компоненты. В результате каждый пиксель изображения характеризовался тремя численными значениями: H, S и L.
2. Выделение пикселей изображения, представляющих сосуды. Пиксель изображения считается принадлежащим сосуду, если его цветовые компоненты удовлетворяют условию: H<0,12 и L<0,7.
3. Удаление «шумовых» компонентов изображения, к которым относятся объекты с площадью менее 7 пикселей.
4. Анализ полученного в результате выполнения данной процедуры бинарного изображения лимфатической сети состоит в подсчете параметров, описывающих относительную площадь, занимаемую сосудами, однородность распределения сети в пространстве и относительную долю крупных сосудов.

Анализ полученного в результате выделения сосудов бинарного изображения лимфатической сети состоит в подсчете параметров, описывающих следующие свойства сети:

1. Относительную площадь, занимаемую сосудами, S (ОПЗС). Общую сумму пикселей сосудов делили на совокупное количество пикселей изображения. ПЛК и ОПЛС (относительная площадь лимфатических сосудов) – синонимы ОПЗС.
2. Однородность (homogeneity, Hm) распределения сети в пространстве. Все изображение разбивали на 100×100 одинаковых фрагментов, затем определяли степень равномерности распределения выделенных пикселей по этим фрагментам. В данном случае определяется энтропия Н = –∑Pi*ln(Pi), где Pi – частота (вероятность) попадания пикселя в i-й фрагмент. Величина изменяется от 0 – все в одном фрагменте, до 1 – равномерное распределение по всем фрагментам.
3. Относительную долю мелких объектов сосудов (шума), Ns (ОДМОС). На бинарном изображении удаляли граничные пиксели (в анализе изображений это называется эрозия). Затем находили отношение площади сосудов нового изображения к площади сосудов исходного изображения. Величина изменяется от 0 (все сосуды мелкие, не соединяющиеся) до 1 (гистологическое изображение не содержит «шум»).
4. Относительную долю крупных сосудов (Ns1, ОДКС). На бинарном изображении многократно (6 раз) удаляли граничные пиксели и находили отношение площади сосудов нового изображения к площади сосудов исходного изображения. Величина изменяется от 0 до 1 (крупные сосуды).
5. Дополнительно (по исходному изображению) определяли среднее значение цветности выделяемых сосудов, СЗЦВС (рис.3,4).

Рисунок 3. Общее сравнение и взаимосвязи численных значений параметров изображений.

Рисунок 4. Графики сравнения значений параметров изображений 40 опухолевых образцов.
На графике A: по оси х – значения относительной площади, занимаемой сосудами, у – доли единицы.
Однородность – наиболее вариабельный параметр.

Результаты исследования

Наше исследование было сфокусировано не на всестороннем анализе патоморфологии рака щитовидной железы, которая хорошо описана в литературе, а на выявлении возможностей обработки изображений при изучении сети лимфатических капилляров. Под инфильтративным ростом мы понимаем диффузное распространение опухоли путем проникновения в окружающие ткани через стадию образования скоплений клеток-инфильтратов. Общеизвестно, что помимо этого типа различают также экспансивный и тотальный рост опухоли. Можно предположить, что паттерн роста опухоли может меняться.

Единственным клинико-морфологическим показателем, который четко и статистически значимо ассоциировался с числовыми значениями параметров, полученных после обработки изображений опухолей, был инфильтративный рост опухоли (рис.5). Наблюдалась корреляция (Pearson correlation = 0,32) относительной площади лимфатических микрососудов с этим параметром (значение двустороннего теста – 0,43; p<0,05). Результаты дисперсионного анализа параметров, полученных при обработке изображений как зависимых, так и независимых (патоморфологических) признаков, подтвердили закономерность, выявленную при корреляционном анализе. Аналогичного исследования на группе пациентов с такими характеристиками никогда ранее не проводилось, и в литературе данных, касающихся компьютер-ассистированного изучения препаратов лимфангиогенеза, нет.

Рисунок 5. Пределы значений площади сосудов при наличии (1) и отсутствии (0) инфильтративного роста опухоли.
Инфильтративный рост ассоциировался с большими значениями площади сосудов.

Заключение

Основной результат исследования – обнаружение зависимости между инфильтративным ростом папиллярных карцином щитовидной железы и относительной площадью капиллярного лимфатического русла, измеренной на цифровых изображениях. Очевидные ограничения нашего исследования: а) малое количество пациентов; б) применение только одной компьютерной программы для обработки изображений без использования гратикулы-сетки Chalkley; в) неоднородность пациентов; г) применение только одного иммунохимического маркера; д) использование неавтоматизированного субъективного выбора зон съемки изображений. Заметим, что эти проблемы преодолимы только при осуществлении дорогостоящего широкомасштабного исследования.

Идеи для дальнейших исследований явлений опухолевого ангио- и лимфангиогенеза:

• выделение субрегионов внутриопухолевой, околопухолевой, подкапсулярной зон опухоли щитовидной железы и съемка изображений в этих зонах;
• применение робот-ассистированного сканирования поверхности всего препарата опухоли;
• изучение паттернов ангиогенеза в тканях организмов, подвергшихся радиации и отравляющих веществ, с целью поиска мишени воздействия радио- и токсо-протекторов и противоопухолевых медикаментов;
• разработка программного обеспечения для дифференциальной диагностики и классификации рака щитовидной железы на основании данных обработки изображений;
• поиск предсказательных факторов – параметров, полученных при процессинге изображений, для прогноза клинико-лабораторного состояния пациентов, перенесших операцию по удалению щитовидной железы;
• выяснение значения относительной площади лимфатических сосудов и других параметров для принятия клинических решений (назначение определенного режима химиотерапии, решение об объеме операции и др.).

Эти направления дальнейшей работы находятся в контексте современных подходов других исследователей лимфангиогенеза при онкологических заболеваниях.

Ссылки на полезные источники и программное обеспечение:

1. www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/
2. en.wikipedia.org/wiki/Reference_management_software
3. download.cnet.com/Viper-the-Anti-plagiarism-Scanner/3000-2051_4-10795356.html
4. download.cnet.com/AntiPlagiarism/3000-2073_4-10454033.html?tag=mncol;1
5. www.brothersoft.com/plagiarism-finder-29261.html
6. www.brothersoft.com/plagiarism-detector-153977.html
7. en.wikipedia.org/wiki/List_of_statistical_packages
8. en.wikipedia.org/wiki/Computer-assisted_translation#Comparison_of_different_CAT_tools