Молекулярно-генетическое тестирование пациентов с немелкоклеточным раком легкого

Значительные успехи в понимании патогенеза и лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), открытие биологической и терапевтической важности приобретенных генетических изменений в двух генах, кодирующих фармакологически целевые тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и киназы анапластической лимфомы (ALK), внесли существенные коррективы в алгоритмы диагностики и, прежде всего, обусловили необходимость обязательного молекулярно-генетического тестирования пациентов.

Основы молекулярно-генетического тестирования

Целесообразность молекулярно-генетического тестирования опухолей легкого стала очевидной после публикации результатов IPASS – первого рандомизированного исследования, продемонстрировавшего преимущества терапии ингибитором тирозинкиназы (ИТК) EGFR гефитинибом у пациентов с прогрессирующим НМРЛ при наличии мутации EGFR по сравнению со стандартной химиотерапией на основе препаратов платины [1].

Двумя годами ранее, в 2007 году, в исследовании Soda с соавт. [2] было выявлено, что инверсия плеча хромосомы 2p ассоциирована с образованием гена слияния EML4-ALK у больных раком легкого. Он выявляется в 7% случаев НМРЛ. При этом скорость ответа на ингибитор ALK кризотиниб при лечении на протяжении 6,4 мес. составляла 57%, а 6-месячная выживаемость без прогрессии, по данным исследования [2], была достигнута у 77% ALK-позитивных пациентов.

Учитывая опубликованные данные о возможностях терапии НМРЛ с мутацией EGFR и быстрый темп работ, открывающих новые горизонты в лечении НМРЛ с транслокацией ALK, три профессиональные организации – Колледж американских патологов CAP, Международная ассоциация по изучению рака легкого IASLC и Ассоциация молекулярной патологии AMP – разработали и опубликовали в 2013 году рекомендации по молекулярному тестированию рака легкого на предмет наличия двух критических предиктивных биомаркеров в клинической практике [3]. В них рассматриваются 5 принципиальных вопросов в отношении молекулярного тестирования НМРЛ:

• Когда должно проводиться молекулярное тестирование?
• Как должно осуществляться молекулярное тестирование на мутацию EGFR?
• Как должно проводиться тестирование транслокации ALK?
• Необходимо ли проводить исследование других генов при аденокарциноме легкого?
• Как необходимо внедрять молекулярное тестирование аденокарциномы на практике?

Когда должно проводиться молекулярное тестирование?

Согласно рекомендациям [3], молекулярному тестированию на мутацию EGFR и транслокацию ALK подлежит либо первичная опухоль, либо ее метастазы. Исследование показано всем пациентам, у которых опухоль содержит элемент аденокарциномы, независимо от клинических характеристик. Цель молекулярно-генетического тестирования заключается в выделении пациентов для таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназы EGFR и ALK.

Исследование мутаций EGFR и транслокации ALK должно проводиться во время диагностики для пациентов с поздней стадией заболевания (IV стадия) или во время рецидива или прогрессии у пациентов с более ранними стадиями, которые не прошли тестирование ранее. Для пациентов I, II и III стадии молекулярно-генетическое тестирование также целесообразно, но решение о его проведении должно приниматься индивидуально [3].

Как выполняется молекулярно-генетическое тестирование на мутации EGFR и ALK?

Методики скрининга пациентов с НМРЛ на наличие «драйвер-мутаций» постоянно совершенствуются, поэтому единых стандартов не существует. Требования, которым должны отвечать современные способы диагностики, включают быстроту проведения тестирования (в идеале – две недели и меньше), доступную стоимость, возможность проведения на клинически доступных образцах материала, а также желательно устранение человеческого фактора с целью исключения вероятности получения ошибочных результатов.

В современной клинической практике для скрининга различных «драйвер-мутаций» используются:

• Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который отличается высокой скоростью проведения (менее 2 недель, анализу подлежат образцы ткани или крови), применяется для обнаружения мутаций EGFR
• Секвенирование ДНК, в ходе которого исследуется вся длина одного гена на наличие мутации. Имеет более низкую чувствительность по сравнению с другими методами, поскольку для получения корректного результата в образце ткани должно содержаться более 10% клеток опухоли с мутацией. В противном случае тест может быть ложноотрицательным
• Аллель-специфическое ПЦР секвенирование, анализирующее ДНК на наличие аномалий. Позволяет обнаруживать редкие сигналы с большей чувствительностью, чем при прямом секвенировании, к тому же проводится в еще более краткие сроки и имеет более низкую стоимость. Отрицательной стороной является возможность идентифицировать только заранее предопределенные мутации. Используется для скрининга мутаций EGFR, HER2, METex14 и некоторых других, более редких аномалий
• Секвенирование следующего поколения (англ. Next-generation sequencing – NGS) позволяет в краткие сроки проводить количественный анализ редких аллелей и одновременно оценивать множественные гены или даже целые геномы. Сохраняет высокую чувствительность в том числе и при анализе образцов ткани с низким содержанием опухолевых клеток, что предоставляет возможность выявлять новые аномалии, которые невозможно выявить аллель-специфическим тестированием. Недостатком метода является его высокая стоимость. Используется для скрининга мутаций EGFR, HER2, METex14, транслокации ALK
• Флуоресцентная гибридизация in situ, или метод FISH (от англ. fluorescence in situ hybridization), позволяет определить последовательность ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Обычно применяется для обнаружения транслокаций генов и других аномалий, в том числе транслокации ALK
• Иммуногистохимический метод (ICH) представляет собой чувствительный способ определения транслокации ALK, который является более точной альтернативой FISH. Кроме того, позволяет выявить экспрессию белка PD-L1 при НМРЛ

Возможности дополнительного тестирования у пациентов с приобретенной резистентностью к ИТК EGFR

Хотя положительные клинические и рентгенографические ответы пациентов с НМРЛ и мутацией EGFR на терапию ИТК EGFR наблюдаются примерно в 70% случаев [3], у большинства больных возникает рецидив и прогрессирование заболевания через 8-16 месяцев после начала лечения, оправдывая клинический феномен, известный под названием приобретенная резистентность.

Самая частая причина развития приобретенной резистентности, мутация Т790М, по данным исследований, крайне редко обнаруживается в образцах материала пациентов, не получавших лечение [4]. В тех единичных случаях, когда ее удается выявить во время начальной диагностики, целесообразно подтвердить ее соматический или зародышевый статус путем тестирования нормальной ДНК пациента. Зародышевые мутации Т790М ассоциируются с семейным раком легкого, и подтверждение этого факта должно стать основанием для обследования и консультирования членов семьи больного [4].

В отношении исследований других мутаций, служащих основанием для развития приобретенной резистентности к ИТК EGFR, в том числе амплификации МЕТ, и других, более редких аномалий, пока не накоплен достаточный клинический опыт, поэтому для формулировки четких рекомендаций требуются дальнейшие исследования [3].

В настоящее время проводится несколько клинических исследований, изучающих возможности преодоления основных механизмов развития резистентности. Вероятно, в скором времени будут сформулированы дальнейшие рекомендации по определению статуса Т790М и амплификации генов, кодирующих другие рецепторы тирозинкиназ. Более того, статус Т790М может стать важным аспектом при принятии решения о целесообразности продолжения терапии ИТК EGFR в случае развития приобретенной резистентности. С целью ее выявления в подобных случаях может проводиться жидкостная биопсия. Она дает возможность определить генотип менее инвазивным и дорогостоящим способом, чем обычная биопсия. К тому же жидкостная биопсия позволяет контролировать молекулярные особенности рака уже в ходе лечения или прогнозировать рецидив после адъювантной терапии [5].

Согласно рекомендациям NCCN по лечению НМРЛ 2017 года, жидкостная биопсия с целью выявления мутаций, ассоциированных с приобретенной резистентностью к ИТК EGFR, назначается только при невозможности проведения традиционной тканевой биопсии [8].

Принцип жидкостной терапии основан на выявлении молекул, которые часто продуцирует опухоль при НМРЛ, с помощью анализа циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) и/или циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК) [6]. Он может давать информацию о молекулярной эволюции опухоли в процессе терапии.

Ограничение жидкостной биопсии, которая предоставляет возможность предсказывать клинический ответ на таргетные препараты, состоит в достаточно низкой ее чувствительности, которая колеблется в пределах 60-80% [7]. Для жидкостной биопсии характерен высокий риск получения ложноотрицательных результатов по сравнению с традиционной биопсией, обусловленный незначительным и нестабильным количеством цоДНК.

Полученные в последнее время данные свидетельствуют, что пациенты с приобретенной резистентностью к ИТК, ассоциированной с мутацией Т790М, могут получать клиническую пользу, продолжая принимать в качестве препаратов первой линии ИТК EGFR [9].

Выбор терапии на основании результатов молекулярно-генетического тестирования

Современные рекомендации по лечению НМРЛ [8] настаивают на необходимости проведения развернутого молекулярно-генетического тестирования с целью выявления не только распространенных, но и редких «драйвер-мутаций» и последующего индивидуального подбора таргетной терапии.

Мутация EGFR

Выявление мутации EGFR является предиктором чувствительности к ИТК EGFR. В частности, протоколы NCCN рекомендуют назначать пациентам с мутацией EGFR в качестве первой линии терапии эрлотиниб или афатиниб или гефитиниб.

Если мутация выявлена уже после того, как начата химиотерапия, рекомендуется завершить терапию или прервать ее и заменить на ИТК EGFR.

Транслокация ALK

Транслокации ALK могут быть выявлены с помощью FISH, иммуногистохимического анализа, а также большинства панелей секвенирования следующего поколения. Их присутствие ассоциируется с высокой чувствительностью к ингибиторам ALK кризотинибу, церитинибу, алктинибу [8]. Пациентам с положительной транслокацией ALK в качестве терапии первой линии показан кризотиниб или церитиниб. Если аномалия выявлена уже во время химиотерапии, предлагается дополнить ее поддерживающей терапией или прервать, заменив на кризотиниб или церитиниб.

Транслокация ROS1

ROS1 представляет собой рецепторную тирозинкиназу, действующую как онкоген у более молодых никогда не курящих пациентов с аденокарциномой. Скрининг транслокации проводится с помощью метода FISH, а также некоторых панелей NGS. Пациенты с транслокацией ROS1 высокочувствительны к терапии кризотинибом[8].

Мутация BRAF

BRAF представляет собой сигнальный медиатор, активирующий митоген-активированную протеинкиназу. Его мутации могут встречаться как в положении экзона 15 V600, так и вне этого домена и обычно ассоциируются с историей курения [10]. Обнаружение аномалии возможно методом секвенирования ПЦР или NGS.

FDA одобрило назначение комбинации дабрафениба и траметиниба пациентам с метастатическим НМРЛ с мутацией BRAF V600E. Также эффективной стратегией, судя по всему, является ингибирование BRAF с помощью низкомолекулярных ИТК вемурафениба и дабрафениба [11].

Мутация HER2

HER2 относится к семейству рецепторов ТК EGFR. Мутация HER2 может быть выявлена методом ПЦР или секвенирования следующего поколения. Пациенты с мутацией HER2 часто реагируют на HER2-таргетные препараты, в частности, трастузумаб [12], и химиотерапию, а также афатиниб [12].

МЕТ-аномалии

Аномалии MET, рецептора тирозинкиназы для фактора роста гепатоцитов, включают «пропуск» 14 экзона в гене MET (встречается при аденокарциноме легких), амплификацию гена MET (выявляется у пациентов с НМРЛ, не проходивших лечение) и комбинацию MET и EGFR (в опухолях с приобретенной резистентностью к ИТК EGFR) [9].

Применение кризотиниба при амплификации МET и мутациях MET и EGFR изучается [14].

Транслокации RET

Ген RET кодирует рецептор тирозинкиназы клеточной поверхности. Его транслокации могут выявляться при аденокарциномах, чаще у более молодых пациентов и курильщиков [15], методами FISH или NGS. При выявлении транслокации RET целесообразно назначать RET-ингибиторы, например, кабозантиниб [16], вандетаниб или алектиниб [17-19].

---

Список литературы

1. Fukuoka M., et al. Biomarker analyses and final overall survival results from a phase III, randomized, open-label, first-line study of gefitinib versus carboplatin/paclitaxel in clinically selected patients with advanced non-small-cell lung cancer in Asia (IPASS). J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2011. Vol.29, №21, P. 2866-2874.
2. Soda M., et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer.
3. Lindeman N.I., et al. Molecular Testing Guideline for Selection of Lung Cancer Patients for EGFR and ALK Tyrosine Kinase Inhibitors: Guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. J. Thorac. Oncol. 2013. Vol.8, №7, P. 823-859.
4. Oxnard G.R., et al. Screening for Germline EGFR T790M Mutations Through Lung Cancer Genotyping. J. Thorac. Oncol. 2012. Vol.7, №6, P. 1049-1052.
5. Abbosh C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 2017. Vol.545, №7655, P. 446-451.
6. Haber D.A., Velculescu V.E. Blood-Based Analyses of Cancer: Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Cancer Discov. 2014. Vol.4, №6.
7. Oxnard G.R., et al. Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. // J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2016. Vol. 34, № 28. P. 3375–3382.
8. Ettinger D.S., et al. Non-Small Cell Lung Cancer, Version 5.2017, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. J. Natl. Compr. Canc. Netw. Harborside Press, LLC, 2017. Vol.15, №4, P. 504-535.
9. Sequist L.V., et al. Genotypic and Histological Evolution of Lung Cancers Acquiring Resistance to EGFR Inhibitors. Sci. Transl. Med. 2011. Vol.3, №75.
10. Sequist L.V., et al. Implementing multiplexed genotyping of non-small-cell lung cancers into routine clinical practice. Ann. Oncol. Oxford University Press, 2011. Vol.22, №12, P. 2616-2624.
11. Planchard D., et al. Dabrafenib in patients with BRAFV600E-positive advanced non-small-cell lung cancer: a single-arm, multicentre, open-label, phase 2 trial. Lancet Oncol. 2016. Vol.17, №5, P. 642-650.
12. Mazières J., et al. Lung cancer that harbors an HER2 mutation: epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives. J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2013. Vol.31, №16, P. 1997-2003.
13. Paik P.K., et al. Response to MET Inhibitors in Patients with Stage IV Lung Adenocarcinomas Harboring MET Mutations Causing Exon 14 Skipping. Cancer Discov. 2015. Vol.5, №8.
14. Camidge D.R. Efficacy and safety of crizotinib in patients with advanced c-MET-amplified non-small cell lung cancer (NSCLC). J. Clin. Oncol. 2014.
15. Takeuchi K., et al. RET, ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat. Med. 2012. Vol.18, №3, P. 378-381.
16. Drilon A., et al. Cabozantinib in patients with advanced RET-rearranged non-small-cell lung cancer: an open-label, single-centre, phase 2, single-arm trial. Lancet Oncol. 2016. Vol.17, №12, P. 1653-1660.
17. Drilon A., et al. Response to Cabozantinib in Patients with RET Fusion-Positive Lung Adenocarcinomas. Cancer Discov. 2013. Vol.3, №6.
18. Falchook G.S., et al. Effect of the RET Inhibitor Vandetanib in a Patient With RET Fusion-Positive Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. J. Clin. Oncol. American Society of Clinical Oncology, 2016. Vol.34, №15, P. e141-4.
19. Detterbeck F.C., et al. The IASLC Lung Cancer Staging Project: Background Data and Proposed Criteria to Distinguish Separate Primary Lung Cancers from Metastatic Foci in Patients with Two Lung Tumors in the Forthcoming Eighth Edition of the TNM Classification for Lung Cancer. J. Thorac. Oncol. 2016. Vol.11, №5, P. 651-665.